鼠李糖乳杆菌fmb-9产抑菌物质的研究及其培养基优化

【摘要】乳酸菌在自然界中大量存在,是最常见的益生菌之一,被广泛应用在食品生产、医疗保健和饲料工业中。乳酸菌能够产生多种生物活性物质,包括细菌素、有机酸和多种酶类,这些活性物质中很多都具有抑菌能力。随着社会的进步和生活水平的提高,人们对于食品安全的要求也越来越高。目前普遍使用的食品添加剂主要是化学添加剂,这类物质的大量使用严重影响着人体的健康。因此,寻找安全、稳定、高效的抑菌物质是目前食品添加剂的主要研究方向。乳酸菌作为一种益生菌,它所产生的抑菌物质是被公认安全的,使用这类物质作为食品添加剂,将会极大的提高我国食品的安全性。乳酸菌fmb-9是本实验室保藏的一株具有抑菌能力的菌株,分离自泡菜中。本研究旨在对乳酸菌fmb-9进行筛选活化和分类鉴定,并分析它所产生抑菌物质的理化性质,初步研究分离纯化方法,最后优化菌株产抑菌物质的培养基,为进一步开发利用天然抑菌物质提供理论基础。具体研究结果如下：1.对保藏的乳酸菌fmb-9进行活化和复壮,并对复壮的菌株进行分类鉴定。菌落形态观察具有典型的乳酸菌特征,革兰氏染色镜检显示阳性,生理生化特性研究初步确定菌株属于乳酸杆菌。在分子生物学鉴定中,通过总基因组提取、PCR扩增,得到长度为1437bp的16SrDNA序列,与GenBank中相关序列进行同源性比对后,根据研究结果构建系统发育树,并对菌株进行了系统发育分析,结果显示菌株fmb-9的16SrDNA序列和数据库中多株菌的序列同源性达到99%以上,确定菌株属于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。2.抑菌实验结果表明,乳酸菌fmb-9产生的抑菌物质具有较广的细菌抑菌谱,能够抑制短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌等致病菌,但对真菌没有抑制效果。生长曲线测定结果表明,菌株生长4h进入对数期,16h进入稳定期；发酵中培养基pH值持续下降,最终稳定在pH3.8；菌株发酵2h即开始产生抑菌物质,36h左右抑菌活性达到最高。抑制排除实验和蛋白酶敏感性实验证明,发酵液的抑菌活性与有机酸和过氧化氢无关,抑菌物质对胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K均有一定的敏感性,推测该物质可能具有蛋白特性。稳定性实验证明,抑菌物质对于温度、pH值、紫外线均有很好的耐受性,其抑菌活性显现范围为pH2.0-5.0,在pH值大于5.0的环境中将失去抑菌能力。3.分离纯化实验证明,酸沉、萃取和层析柱分离对乳酸菌fmb-9产生的抑菌物质均有较好的纯化效果。抑菌物质在pH2.0处不被沉降；该物质易溶于甲醇中,基本不能被正己烷和乙酸乙酯溶解；葡聚糖凝胶柱层析能够有效分离抑菌物质。初步的分离流程为：首先调节发酵液为pH2.0进行酸沉,其次使用正己烷和乙酸乙酯萃取,对萃余液进行浓缩后采用甲醇复溶,溶液经葡聚糖凝胶柱层析分离。抑菌物质的最大吸收峰在222nm处,通过HPLC分析认为该物质具有较大的极性。4.选择番茄培养基1号作为初始培养基。通过培养基组分筛选,选出最合适的发酵材料为番茄汁、土豆汁、玉米汁,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为大豆蛋白胨。通过单因素实验、关键因素筛选实验选出葡萄糖和大豆蛋白胨两个关键因素。根据最陡爬坡实验、中心组合实验、响应曲面分析,确定培养基各组分的最佳用量分别为：葡萄糖50.74g/L,大豆蛋白胨47.80g/L,番茄汁10ml/L,土豆汁20m1/L,玉米汁10ml/L,吐温801.0ml/L,磷酸氢二钾0.5g/L,此时抑菌圈直径达到13.55mm,比优化前提高了15.80%。
【作者】王俊琦；
【导师】陆兆新；
【作者基本信息】南京农业大学，食品科学，2013，硕士
【关键词】鼠李糖乳杆菌fmb-9；抑菌物质；理化性质；分离纯化；培养基优化；

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